Разработана система последовательных приемов по подбору эффективных микробиологических препаратов защиты растений земляники от фитопатогеннов. Выделение микроорганизмов из пораженных участков листьев проводили по общепринятой методике, антагонистическую активность микробиологического препарата «Эмбико» изучали методом агаровых блоков, глубинным способом. Установлено что, использование лабораторной диагностики позволяет сократить время на подбор эффективного средства защиты растений.

Ключевые слова: фитопатогенные микроорганизмы, культура in vitro, антагонистическая активность, микробиологический препарат «Эмбико».

Введение. Перспективным направлением современной агробиотехнологии является использование биологических средств защиты растений на основе микроорганизмов и их метаболитов, которые проявляют фитозащитные, ростостимулирующие свойства, повышают устойчивость растений к вредителям, заболеваниям, стрессовым факторам [1]. В литературе встречаются данные о подавлении фитопатогеннов микромицетами [2], бациллами различных таксономических групп [3], азотофиксирующими бактериями [1] и препаратами, созданными на их основе.

Молочнокислые бактерии известны своими свойствами подавлять кишечные условно-патогенные микроорганизмы, поэтому они лежат в основе многих препаратов, направленных на профилактику и борьбу с кишечными инфекциями. Роль молочнокислых бактерий в подавлении микроорганизмов, вызывающих заболевания у растений недооценена и мало изучена. Поэтому, молочнокислые бактерии и созданные на их основе микробиологические препараты представляют интерес для изучения их действия на возбудителей заболевания растений.

Эффективность примененных биологических средств защиты растений во многом зависит от их активности по отношению к конкретному возбудителю. При диагностике заболеваний сельскохозяйственных культур не всегда можно выявить возбудителя по симптомам и соответственно нельзя правильно подобрать средство защиты растений. В этих случаях подбор эффективного микробиологического препарата, способного подавить данных возбудителей заболеваний, возможно только с помощью ряда последовательных биотехнологических приемов.

Применение химических средств защиты растений имеет существенные недостатки, т. к. большинство синтетических средств накапливается в продуктах и почве, делая их неприемлемыми для использования [2]. По этой причине единственно правильным направлением в борьбе с бактериальными инфекциями является использование биопрепаратов, обеспечивающих обеззараживание почвы, растений и посадочного материала. К тому же биологические средства защиты растений обладают специфичностью действия, не вызывает мутагенной активности, приводящей к появлению резистентных штаммов фитопатогенных микроорганизмов.

Микробиологические препараты снижают химическую нагрузку на агроценоз и ландшафт, способствуют восстановлению нормальной структуры микробиоценоза почвы. Микроорганизмы-антагонисты заселяя ризосферу растений, создают длительный положительный эффект, проявляющийся в подавлении развития фитопатогеннов.

В некоторых случаях применение химических средств защиты растений невозможно, ограничений по применению микробиологических препаратов нет. В случаях необходимости проведения завершающих фунгицидных обработок плодоовощной продукции и обеспечения сохранности урожая при хранении и транспортировке применение химических препаратов по санитарным причинам невозможно.
В связи с вышесказанным, целью нашей работы является разработка системы последовательных приемов по подбору эффективных микробиологических препаратов защиты растений земляники от фитопатогеннов.

Материалы и методы. Материалом исследования служили растения земляники (Fragaria ananassa) сорта Клери, пораженные бактериальной инфекцией.

В качестве биологического препарата для борьбы с заболеваниями использовали микробиологический препарат «Эмбико» и штаммы молочнокислых бактерий, входящих в его состав. Микробиологический препарат представляет собой жидкую культуру, включающие микроорганизмы и их метаболиты. «Эмбико» - это консорциум следующих физиологических групп микроорганизмов: фототрофные аноксигенные пурпурные несерные бактерии, молочнокислые гомоферментативные стрептобактерии и стрептококки, одноклеточные грибы Saccharomyces. Микроорганизмы, входящие в состав «Эмбико» имеют высокую естественную предрасположенность к росту и размножению в почве, ризосфере, ризоплане и эпифитной сфере растений, стимулируют рост и развитие растений, оказывают антистрессовый эффект. Антагонистическая активность микробиологического препарата обусловлена метаболитами молочнокислых бактерий (Streptococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei): антибиотическими веществами и органическими кислотами.

Для выделения фитопатогенных микроорганизмов листья клубники очищали от внешних источников инфекции в растворе хозяйственного мыла в течение 2-5 минут, затем тщательно промывали водой, высушивали. Стерильным скальпелем вырезали участок поврежденной ткани и помещали его в каплю физиологического раствора. Листья измельчали с помощью стеклянной палочки и оставляли на 10 минут. Суспензию высевали на твердые неселективные питательные среды NA и Кинг В [4].

Выделенные штаммы микроорганизмов изучали на наличие факторов патогенности: определяли способность мацерировать растительную ткань в культуре in vitro и вызывать ее некроз (реакция гиперчувствительности). Способность мацерировать растительную ткань проверяли на дисках растительной ткани по общепринятой методике [4]. Наличие или отсутствие мацерации определяли визуально и при прикосновении к дискам бактериологической петлей на 3 сутки. Для проведения реакция гиперчувствительности исследуемые бактериальные штаммы инкубировали на скошенном агаре в течение 24 ч. Клетки смывали с помощью 3-4 мл физиологического раствора и вводили с помощью стерильного шприца в поврежденный локально лист. Также, с помощью стерильного скальпеля растению были нанесены многочисленные порезы, на которые наносили капли исследуемых фитопатогенов. В качестве контроля использовали введение стерильного физиологического раствора.

Антагонистическую активность молочнокислых бактерий и микробиологического препарата «Эмбико» изучали методом агаровых блоков, глубинным способом. 1 мл каждого штамма молочнокислых бактерий и препарата «Эмбико» вносили в стерильную чашку Петри и смешивали с нагретой и вновь охлажденной до 45 °С средой МRS [5], тщательно размешивали и инкубировали при 37 ºС 24 часа. Суточные культуры фитопатогенных микроорганизмов вносили в чашки Петри смешивали с нагретой и вновь охлажденным до 45°С питательной средой Кинг В, тщательно размешивали. После застывания среды вырезали 4-6 лунок, в которые вставляли блоки МRS с глубинно выращенными молочнокислыми бактериями и «Эмбико», вырезанные тем же пробочным сверлом. После внесения блоков в лунки, чашки Петри помещали на экспозицию на 5 часов при 5 °С для диффузии метаболитов микроорганизмов «Эмбико» в агаровую пластинку. Затем чашки Петри инкубировали при температуре 22 °С 18-24 часа. На следующие сутки измеряли диаметр зоны задержки роста фитопатогенных микроорганизмов в мм [6].

Эксперименты проводили в 3-4 биологических повторностях. Достоверность различий между вариантами оценивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты. Земляника садовая имела поражения на листьях в виде некрозов (пятнистостей), характерных для бактериозов. Внешнего осмотра симптомов бактериоза оказалось не достаточно для установления возбудителя заболевания, поэтому была применена дополнительная лабораторная диагностика с использованием методов культуры in vitro.

В процессе исследований из пораженной ткани было выделено 2 штамма микроорганизмов. Штамм 1 образовывал круглые гладкие однородные колонии желтого цвета и тягучей консистенцией, профиль выпуклый. При микроскопировании были обнаружены кокки. Штамм 2 имел круглые гладкие однородные колонии грязно-белого цвета, не тягучие, профиль выпуклый. Микроскопирование препаратов показало наличие коротких палочек.

Исследование способности штаммов 1 и 2 мацерировать растительную ткань картофеля показало, что штамм 1 вызывал мацерацию тканей на 2-е сутки, а штамм 2 – на 3-е сутки. Диски, обработанные двумя штаммами одновременно, были мацерированы на 2-е сутки. Проведение реакции гиперчувствительности показало почернение участка листовой пластинки в течение 3 суток в месте введения бактериальной суспензии после инокуляции. При введении фитопатогенов через многочисленные порезы, растение погибало на 3 сутки.

Изучение антагонистической активности молочнокислых бактерий и микробиологического консорциума по отношению к выделенным фитопатогеннам показало, что штаммы молочнокислых бактерий имели следующие зоны подавления: L. сasei 26,7±1,5 мм, L. plantarum 27,0±1,0 мм, Str. lactis 29,0±1,0 мм. Микробиологический препарат «Эмбико» образовывал наибольшую зону подавления – 34,4±1,2 мм. Наличие зоны подавления размером 20 мм свидетельствует об антагонистической активности исследуемого препарата по отношению к исследуемым патогеннам. Таким образом, в результате исследований было показано, что микробиологический препарат «Эмбико» обладает высокой антагонистической активностью по отношению к выделенным фитопатогеннам земляники.

Обсуждение. Многообразие проявления патологических изменений растений, вызванные фитопатогенными микроорганизмами, привело к тому, что для точного определения болезни, кроме внешнего осмотра пораженного растения, необходимы дополнительные лабораторные исследования с целью установления возбудителя. Ситуация усложняется еще тем, что бактериозы могут быть вызваны не только как самостоятельные инфекции, но и совместно несколькими возбудителями. Для лабораторной диагностики используют методы культуры in vitro и биологические исследования.

Методы культуры in vitro заключаются в выделении возбудителя болезни в чистую культуру, изучении его культурально - морфологических, физиолого-биохимических признаков, проверке на наличие факторов патогенности. Биологические исследования включают искусственное заражение растений возбудителем с последующим сравнительным изучением симптомов поражения на растении хозяине и растение – тесте, изучение факторов, которые способствуют или сдерживают развитие болезни. Повторное заражение растений выделенным возбудителем заболевания позволяет сравнить симптомы и убедиться в правильности выделенного источника заболевания. Определения микроорганизма позволяет подобрать средство защиты растений (схема 1). Приведенная система последовательных действий занимает много времени, что в случае массового инфицирования растений может привести к гибели популяции.

Предлагаемая нами система последовательных приемов с использованием данных антагонистической активности микробиологического препарата по отношению к возбудителю заболевания, позволяет в короткие сроки и эффективно произвести подбор средства защиты растений (схема 2). После выделения микроорганизмов и определения факторов патогенности одновременно ставят тест на гиперчувствительность и на антагонистическую активность различных микробиологических препаратов. Это позволяет сократить сроки исследования, т.к. подбор средств защиты растений основан не на идентификации микроорганизма, а на зонах подавления фитопатогенна микробиологическими препаратами. Такой подход позволяет сократить сроки и подобрать микробиологический препарат (а не химическое средство!), эффективность которого к выделенным фитопатогеннам подтверждена лабораторными исследованиями. Таким образом, перед внесением микробиологического препарата в популяцию уже заранее известна его эффективность.

В наших исследованиях по изучению заболеваний земляники, по внешним симптомам возбудитель не был выявлен. Выделение из пораженной ткани растений микроорганизмов и изучение их на наличие факторов патогенности показало, что оба выделенных штамма обладали патогенными свойствами, причем интенсивность мацерации растительной ткани увеличивалась при одновременном действии двух штаммов, нежели каждого по отдельности. Это затруднило определение возбудителя по внешним проявлениям заболевания и привело к сложности в подоборе эффективного средства защиты растений.

Проведение реакции гиперчувствительности показало, что симптомы зараженного растения совпадали с симптомами растения, из которого производили выделение фитопатогеннов. Также, в ходе заражения растения возбудителями было выявлено, что заболевание развивается очень стремительно (растения погибали через три дня после заражения) и подбор средств защиты растений необходимо провести в краткие сроки.

Изучение культурально - морфологических, физиолого-биохимических признаков, идентификация фитопатогеннов и подбор средства защиты требует длительного времени, поэтому этот этап был отложен. Использование изучения антагонистической активности микробиологических препаратов по отношению к выделенным фитопатогеннам позволяет не идентифицируя возбудителя в 3-х дневный срок определить эффективность микробиологического препарата.

На сегодняшний день микробиологические препараты разрабатывают на основе различных групп микроорганизмов и с различным количеством штаммов, входящим в состав. Наиболее перспективными являются многокомпонентные препараты перед монокультурными, т. к. микроорганизмы, входящие в состав препарата обладают различной антагонистической активностью по отношению к различным фитопатогеннам.

Целесообразность многокомпонентных препаратов состоит в том, что совокупная антагонистическая активность всех штаммов должна быть выше, чем каждого штамма в отдельности.

Выводы. Таким образом, в результате исследований было показано, что микробиологический препарат «Эмбико»® обладает высокой антагонистической активностью по отношению к выделенным фитопатогеннам земляники. Для эффективной борьбы с фитопатогеннами, поражающими растения, рекомендуется лабораторная диагностика, в ходе которой выделяют возбудителей заболевания и методом изучения антагонистической активности подбирают биологический препарат, эффективный против данного источника инфекции.

Список литературы
1. Иутинская Г.А., Титова Л.В., Белявская Л.А., Козырицкая В.Е. Основные направления создания микробных препаратов для биологического контроля численности фитопатогеннов и фитогельминтов // Мікробні біотехнології: актуальність і майбутнє – Radostim-2012 : материалы Межд. науч.-практ. конф. (Київ, 19–22 листопада 2012 г.). – C 127-128.
2. Чернюк Б.В., Омельчук Є.О., Красинько В.О. Антагоністичні властивості Aspergillus sp262 по відношенню до фітопатогенних грибів роду Fusarium // Мікробні біотехнології: актуальність і майбутнє – Radostim-2012 : материалы Межд. науч.-практ. конф. (Київ, 19–22 листопада 2012 г.). – C 345-346.
3. Актуганов Г. Э., Мелентьев А. И., Галимзянова Н. Ф. Особенности антагонистического взаимодействия различных таксономических групп бацилл с почвенными грибами. М.: Материалы конференции «Микроорганизмы и биосфера», 19-20 ноября 2007. – С 3-4.
4. Желдакова Р.А., Мямин В.Е. Фитопатогенные микроорганизмы. Учебно-методический комплекс. Минкс, БГУ, 2006. – С 116.
5. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М.: Наука, 1975. 390 с.
6. Омельченко С.О., Ржевская В.С. Изучение антагонистической активности микробиологического консорциума «Эмпробио» в отношении SALMONELLA TIPHOMURIUM 144 // Ученые записки Крымского инженерно-педагогического университета, - Симферополь: Крымский инженерно-педагогический университет 2011. –Сер. «Биологические науки».- 2011.- Вып. 31. –С. 38-41.

ВПЛИВ МІКРОБІОЛОГІЧНОГО ПРЕПАРАТУ «ЕМБІКО» НА ЗБУДНИКІВ БАКТЕРІАЛЬНИХ ХВОРОБ СУНИЦІ

В.С. Ржевська *, Л.М. Теплицька *, З.С. Куртієва **

* Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського, м. Сімферополь, 95007, ул. Ялтинська, 4
** ТОВ «Пансіонат« Орбіта-2 », м. Євпаторія, 97400, Красноярске шоссе, 15

Розроблено систему послідовних прийомів з підбору ефективних мікробіологічних препаратів захисту рослин суниці від фітопатогенів. Виділення мікроорганізмів з уражених ділянок листя проводили за загальноприйнятою методикою, антагоністичну активність мікробіологічного препарату «Ембіко» вивчали методом агарових блоків, глибинним способом. Встановлено що, використання лабораторної діагностики дозволяє скоротити час на підбір ефективного засобу захисту рослин.
Ключові слова: фітопатогенні мікроорганізми, культура in vitro, антагоністична активність, мікробіологічний препарат «Ембіко».

EFFECT OF MICROBIOLOGICAL DRUG "EMBIKO" ON FOR AGENTS BACTERIAL DISEASES STRAWBERRIES

VS Rzhevskaya *, LM Teplitskaya * ZS Kurtieva **
*Tavricheskiy National University named after V.I. Vernadsky, Simferopol, 95007, Yaltinskay st. 4
**"Pansionat" Orbita-2 " Ltd., Eupatoria, Krasnoyarsk Highway 15

A system of sequential methods for the selection of effective microbial agents protect strawberry plants from phytopathogenes. Isolation of microorganisms from infected areas of leaves was carried out by conventional methods, antagonistic activity of microbial drug "Embiko" studied by the agar blocks, deep way. Found that the use of laboratory diagnostics can reduce the time for the selection of effective crop protection.
Keywords: phytopathogenic microorganisms, culture in vitro, the antagonistic activity, microbiological drug "Еmbiko".

Отзывы: