У статті наведені матеріали про антагоністичну активність пробіотическої консорціума «Ємпробіо» по відношенню к Salmonella tiphomurium 144.
Ключові слова: «Ємпробіо», антагоністична активність, Salmonella tiphomurium.

В статье представлены материалы об антагонистическую активность пробиотического консорциума «Эмпробио» по отношению к Salmonella tiphomurium 144.
Ключевые слова: «Эмпробио», антагонистическая активность, Salmonella tiphomurium.

This article presents material on the antagonistic activity of probiotic consorcium «Emprobio» in relation to Salmonella tiphomurium 144.

Key words: «Emprobio» antagonistic activity, Salmonella tiphomuriumIn materials of article about.

В птицеводстве и животноводстве происходит интенсивное накопление микрофлоры, как в помещениях, так и в окружающей среде. Длительное использование антибиотиков широкого спектра действия в больших дозах может привести к развитию резистентности к антибиотикам условно-патогенной микрофлоры. Скорость приспособления бактерий к антибиотикам намного превышает скорость создания антибиотиков, поэтому, часто антибиотикотерапия не эффективна при лечении заболеваний, как у птиц и животных, так и у людей.

Одним из перспективных направлений в этой области стало применение пробиотиков. Пробиотики - микробные препараты, представляющие собой культуры микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью по отношению к патогенной микрофлоре. По эффективности действия пробиотики не уступают некоторым антибиотикам и химиотерапевтическим средствам. К тому же они не оказывают губительного действия на микрофлору пищеварительного тракта, не загрязняют продукты животноводства и окружающей среды, то есть являются экологически чистыми. Использование пробиотиков безопасно для людей, потребляющих животноводческую продукцию. Пробиотики могут не только нормализовать качественный и количественный состав кишечной микрофлоры после использования антибактериальных средств, но во многих случаях они могут быть единственным эффективным методом лечения, профилактики и стимулирования продуктивности сельскохозяйственных животных и птиц (1).

Одним из основных компонентов пробиотических препаратов чаще всего являются бактерии рода Lactobacillus (2). Несмотря на несомненные успехи, достигнутые при изучении пробиотических микроорганизмов, в частности, молочнокислых бактерий, многое до сих пор остается неясным. Отсутствие стандартных методов исследования пробиотиков затрудняет сравнительный анализ различных штаммов молочнокислых бактерий. В связи с этим разработка методологии сравнительного исследования пробиотических культур являются актуальной проблемой современной микробиологии (3).

При исследовании антагонистической активности в качестве тест – культуры используют условно – патогенные микроорганизмы. Сальмонелла в естественных условиях являются возбудителями септических инфекций, поражений ЖКТ, пневмоний, абортов у животных. (4.) Основной источник сальмонеллезов – домашние животные (крупный и мелкий рогатый скот, свиньи и др.), грызуны и птицы. Реже источниками заболевания являются люди. Основной путь передачи инфекции – пищевой. Факторами передачи могут быть мясо, молоко, яйца животных и птиц. Наиболее восприимчивы к заболеванию люди со сниженным иммунным статусом (в том числе грудные дети) и больные, получающие антибиотики. (5)

Сальмонеллы долго сохраняют жизнеспособность во внешней среде - при комнатной температуре сальмонеллы выживаютнесколько месяцев. Исходя из вышесказанного, целью нашей работы является изучение антагонистической активности пробиотической ассоциации «Эмпробио» по отношению к Salmonella tiphomurium различными методами.

Материалы и методы.

Материалом исследования являлись пробиотический консорциум молочнокислых бактерий «Эмпробио»: Lactobacillus acidophilus 317/402, Lactobacillus plantarum 20, Lactobacillus casei 6, Streptococcus lactis 2/4 и дрожжей: Saccharomyces cerevisiae 75. В качестве тестового микроорганизма использовали эталонный штамм Salmonella tiphomurium 144.

Тестовый микроорганизм использовали в следующих вариантах:
1. суточную культуру Salmonella tiphomurium 144, выращенную на МПА, без разведений;
2. суточную культуру Salmonella tiphomurium 144, выращенную на питательном бульоне, без разведений (18 млрд. клеток в 1 см3 взвеси)
3. 1 млрд. клеток S. tiphomurium 144 в 1 см3.

Жидкий пробиотический консорциум микроорганизмов культивировали при 37º С в течение 3 суток, блоки пробиотической композиции получали на среде МRS, внесением жидких культур глубинным методом (10 млн. кл в 1 см3). Термостатировали при 37º С в течение суток.

Исследования антагонистической активности пробиотического консорциума проводили методом агаровых блоков (глубинным и поверхностным), штаммов молочнокислых бактерий исследовали методом агаровых блоков глубинным способом (7). Количество инокулируемой S. tiphomurium 144 – 1,5 млрд. кл в 1 мл., концентрация штаммов молочнокислых бактерий – по 10 млн. кл.
Поверхностный метод. 0,1 мл взвеси S. tiphomurium 144 равномерно высевали в чашки Петри на поверхность агаровой пластинки со средой МПА. Из агаровой пластинки вырезали симметрично расположенные лунки диаметром 10 мм.

Глубинный метод применяли в двух вариантах. В первом варианте 1 см3 иннокулята смешивали с нагретым и вновь охлажденным до 50°С агаром и затем разливали в чашки Петри. Во втором случае дополнительно 0,5 мл взвеси S. tiphomurium наносили на застывшую агаровую пластинку и стерильным шпателем распределяли по ее поверхности.

Из агаровых пластинок полученных поверхностным и глубинным методами вырезали симметрично расположенные диски диаметром 10 мм, в отверстия вносили 4-6 симметрично расположенных блоков МRS с глубинно выращенным пробиотическим консорциумом микроорганизмов.

После внесения блоков в лунки, часть чашек помещали на экспозицию при 5 °С на 5 часов. Вторую часть исследуемых чашек Петри сразу после посева помещали в термостат. Все чашки термостатировали при температуре 37°С 18-24 часа, до появления на поверхности среды сплошного слоя колоний, на следующие сутки измеряли диаметр зоны задержки роста S. tiphomurium 144 в мм.
Результаты и обсуждение. Результаты исследований показывают высокую антагонистическую активность пробиотического консорциума «Эмпробио» по отношению к S. tiphomurium 144. При глубинном посеве, зоны задержки роста тест - штамма сальмонеллы были больше, чем при поверхностном посеве, не зависимо вариантов экспозиции чашек Петри с посевами (Р<0,01) При поверхностном методе посева отмечена наибольшая зона задержки роста тест - штамма S. typhimurium 144 без разведения, при глубинном – 18 млрд взвеси клеток тест - штамма (табл. 1 и табл.2).

Таблица 1 Антагонистическая активность пробиотического консорциума «Эмпробио» поверхностным методом

Таблица 2 Антагонистическая активность пробиотического консорциума «Эмпробио» глубинным методом

В вариантах с использованием предварительной экспозицией при 5°С в течении 5 часов зоны подавления были больше как при поверхностном посеве (табл. 1), так и при глубинном (табл.2). Экспозиция при низких положительных температурах позволяет метаболитам молочнокислых бактерий диффундировать в толщу среды и тем самым задерживает рост условно-патогенного микроорганизма (рис. 1).

Рис. 1. Антагонистическая активность пробиотического консорциума «Эмпробио» по отношению к S. tiphomurium144.

Дополнительное внесение на глубинный посев 0,5 мм жидкой культуры пробиотического консорциума так же оказало положительное влияние на антагонистическую активность исследуемой ассоциации, но в меньшей степени, чем при глубинном посеве.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшее влияние консорциум «Эмпробио» оказывает на сальмонеллу при ее глубинном посеве, с предварительной постановкой чашек в холодильник на 5 часов для преддиффузии.
Изучение антагонистической активности штаммов консорциума показало, что каждый штамм молочнокислых бактерий в отдельности имел зоны подавления меньше, чем в ассоциации. Например, штаммы Streptococcus lactis 2/4 и Saccharomyces cerevisiae 75 не обладают антагонистической активностью по отношению к S.tiphomurium.

Наибольшая зона задержки роста сальмонеллы отмечена при воздействии Lactobacillus plantarum 20 на микроорганизм (табл. 3, рис. 2).

Рис. 2 Антагонистическая активность трех штаммов пробиотического консорциума «Эмпробио» по отношению к S. tiphomurium 144: А - Lactobacillus plantarum 20; Б - Lactobacillus casei 6; В - Lactobacillus acidophilus 317/402.

Таблица 3. Антагонистическая активность штаммов молочнокислых бактерий пробиотической композиции в отдельности глубинным методом

Таким образом, антагонистическая активность пробиотической ассоциации бактерий и дрожжей выше, чем отдельных штаммов молочнокислых бактерий.

Выводы.

1. Пробиотический консорциум «Эмпробио» обладает антагонистической активностью по отношению к Salmonella tiphomurium 144.
2. При исследовании антагонистической активности штаммов микроорганизмов с разными питательными потребностями метод агаровых блоков с глубинным посевом и экспозицией при низких положительных температурах является предпочтительнее, чем методы с поверхностным внесением и без экспозиции в холоде.
3.  Создание пробиотических композиций, состоящих из нескольких штаммов молочнокислых бактерий с высокой антагонистической активностью является более перспективным направлением, чем монокультурные пробиотики.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ржевская В.С. Перспективы применения пробиотиков в птицеводстве и животноводстве / Ржевская В.С., Теплицкая Л. М. // Сборник научных трудов по материалам VII международной научно- практической конференции «Современные вопросы науки ХХI век» (29 марта 2011 г.) – Тамбов: Издательство ТОИПКРО, 2011. - Выпуск VII, часть 3, С. 111-114.
2. Соловьева И.В. Изучение биологических свойств новых штаммов рода Lactobacillus / Соловьева И.В., Точилина А.Г., Новикова Н.А., Белова И.В., Иванова Т.П., Соколова К.Я. // Вестник Нижегородского университета им.Н.И. Лобачевского, 2010, № 2 (2), с. 462 – 468.
3. Ермоленко Е.И. Молочнокислые бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту: автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Ермоленко Е.И. - Санкт-Петербург, 2009, - 27 с.
4. Ветеринарная микробиология/ П.А. Емельяненко, Г.В. Дунаев, Д.Г Кудлай и др. Учебники и учебные пособия для высш. с/х учебн. завед. - 304 с.
5. Воробьев А. А. Медицинская и санитарная микробиология: Учебное пособие для высших мед. учебн. завед. / Воробьев А. А., Кривошеин Ю.С., Широбрков В.П. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 464 с.
6. О.К. Поздеев, Медицинская микробиология. Под ред. Акад. РАМН В.И. Покровского, Учебник для ВУЗов, Москва, ГЭОТАР, 2001, 767 стр.
7. Зенова Г.М. Практикум по биологии почв: практикум по биологии почв / Зенова Г.М., Степанов А.Л., Лихачев А.А., Манучарова Н.А. – М.: Изд-во МГУ, 2002. – 120 с.

Отзывы: